Forschung
Das von Noe German Pasteris identifizierte Gen FGD1 auf dem X-Chromosom scheint eine wichtige Rolle bei einigen Aarskog-Scott-Patienten zu spielen. Die Aminosäurensequenz des Facio-Genital-Dysplasie-Protein-1 ist bekannt und mittels verschiedener Algorithmen aus der Bioinformatik konnten durch den Vergleich mit anderen Proteinen einige Domänen bzw. Funktionseinheiten des Proteins entdeckt werden. So scheint FGD1 ein spezifischer GTP-Exchange-Faktor (GTP-Austauschfaktor) für CDC42 (ein kleines G-Protein) zu sein. Neben dieser Funktion scheinen aber noch weitere Signaltransduktionswege von FGD1 beeinflusst zu werden.
Lesen Sie hier mehr über die verschiedenen Varianten des FGD1, die Struktur des FGD1 Proteins und dessen Domänen. Daneben soll hier auch eine grobe Übersicht über die bisher bekannte Funktion des Facio-Genital-Dyspalsie-Protein-1 gegeben werden. Hierbei wird vorallem auf die GEF-Funktion für Cdc42 eingegangen.
Verschiedene FGD-1 Splicevarianten
Nachdem die DNA aus dem Genom abgelesen wurde und in die prä-mRNA transkribiert (umgeschrieben) wurde enthält sie neben den Exons ebenfalls auch noch alle Introns. Diese prä-mRNA wird noch prozessiert (verändert) bis sie die endgültige Form erreicht hat und über Transportsysteme aus dem Zellkern geschläust wird. Aber auch dieser Prozess, der auch Splicen genannt wird, muss geregelt ablaufen. Man hat neben einigen grundlegenden Mechanismen auch Sequenzabschnitte an denen "gespliced" wird entdecken können. Die verschiedenen Splicevarianten können regulatorische Wirkung haben, so dass zum Beispiel das Protein später zwar an seine Interaktionspartner binden kann, aber keine Funktion hat und somit das "richtige" Protein verdrängt, aber es sind noch viele weitere Möglichkeiten denkbar. Ebenfalls kann eine Splicevariante spezifisch für ein Organ bzw. Gewebe sein, da sich die Funktion des Proteins dadurch verändern kann.
Bisher wurden für FGD1 3 Splicevarianten neben der "normalen" gefunden. Eigentlich lässt sich hier nicht wirklich von einer "richtigen" Variante sprechen, da jede Variante ihre Funktion besitzt. Wenn hier von "richtig" die Rede ist, wird damit die Variante gemeint, in der alle Introns vollständig entfernt wurden und nur noch die 18 Exons auf der mRNA zu finden sind.
Die erste Splicevariante wurde von Pasteris im Jahre 1997 beschrieben. Hierbei wird nicht nur das 5. Intron (zwischen Exon 5 und Exon 6) komplett herausgespliced, sondern auch noch sehr große Teile des Exon 6. Es werden hierbei 105nt mehr entfernt und damit die DH-Domäne der Dbl-Domäne trunkiert (siehe unten). Es ist anzunehmen, dass dadurch die GEF-Aktivität auf Cdc42 nicht mehr korrekt funktioniert. Diese Splicevariante wird deshalb auch als 6B bezeichnet, im Vergleich zur "normale" 6A. In der Literatur wurde gezeigt, dass diese Splicevariante keine bzw. eine sehr stark verminderte GEF-Funktion gegenüber Cdc42 besitzt. Es scheint sich hierbei um eine Dominant-Negative-Variante zu handeln. Da die erste Domäne (Proline-reich) vorhanden ist bindet es an die richtige Stelle in der Zelle (siehe unten). Durch die Anwesenheit dieser Splicevariante wird der "Platz" für die "korrekte" Variante versperrt. Es bindet die inaktive, was zu keiner GEF-Aktivität führt und die aktive Form, die eine GEF-Aktivität besitzt, kann nicht wirken, da ihr eigentlicher "Platz" versperrt ist.
In der zweiten Splicevariante, die von Yanagi in Okinawa (Japan) 2004 entdeckt wurde das komplette Intron 7 (Intron zwischen Exon 7 und Exon 8) nicht herausgespliced. Dieses Intron 7 hat eine Länge von 400 Nukleotiden (Basen - keine Basenpaare, denn die mRNA ist immer einsträngig). Eigentlich müsste jetzt das Gesamtprotein länger sein, dem ist aber nicht so. Die mRNA wird in sogenannten Codons abgelesen. Kurz gesagt bedeutet dies, dass 3 Basen auf der mRNA einer Aminosäure entsprechen. Die Zahl 400 ist jedoch nicht durch 3 teilbar. Aus diesem Grund stimmt das Leseraster nichtmehr. In diesem konkreten Fall bedeutet dies, dass sich ein STOP-Codon einschleicht und ebenfalls die DH-Domäne der Dbl-Domäne die für die GEF-Funktion wichtig ist trunkiert wird und das FGD-1-Protein später nach der trunkierten DH-Domäne aufhört und lediglich 542 Aminsäuren lang ist, statt 961 Aminosäuren. Zusammenfassend lässt sich also sagen, die mRNA ist um 400 Basenpaare länger, aber durch das veränderte Leseraster wird nurungefähr die Hälte in Aminosäuren übersetzt, da ein STOP-Codon abgelesen wird. Das Protein ist deshalb trotz der längeren mRNA deutlich kürzer. Diese Splicevariante wird als 7B bezeichnet, im Vergleich zur "normalen" mit 7A.
Die dritte Splicevariante geht ebenfalls auf Yanagi zurück. In dieser Splicevariante wird ein Stück, um genau zu sein 59 Nukleotide des Introns 8 (Intron zwischen Exon 8 und Exon 9), nicht heraus gespleißt. Da auch die 59 nicht durch 3 teilbar ist verschiebt sich das Leseraster. Durch den "frame shift" (eine gebräuchliche Bezeichnung für dieses Ereignis) rutscht gleich wie bei 7B ein STOP-Codon in den Leseraster und das Protein wird lediglich 569 Aminosäuren lang im Vergleich zu 961 in der "normalen" Variante. Auch bei dieser Variante wird die DH-Domäne der DBl-Domäne die für die GEF-Funktion wichtig ist trunkiert.
Es ist möglich, dass im Laufe der Zeit noch weitere alternative Splicevarianten beschrieben werden. Neben diesen, bei denen immer die Dbl-Domäne betroffen ist sind auch andere Varianten denkbar, wenn auch eher unwahrscheinlich. Es macht Sinn, dass die Zelle diese Varianten als sogenannte "Dominative Negative Varianten" nutzt. Darunter versteht man, dass diese Variante zwar an die selbe Stelle bindet und somit den Platz für die "normale" Form versperrt, aber keine Funktion ausübt - da ja die GEF-Funktion zerstört ist. Da der N-Terminale Teil (also der Anfang des Proteins) für FGD1 die Lokalisation in der Zelle bestimmt scheint diese Möglichkeit sehr wahrscheinlich.
Weiterhin ist es sehr gut vorstellbar, dass bei Patienten die keine Mutation im FGD1 aufweisen aus irgendeinem Grund eine Disbalance zwischen verschiedenen Splicevarianten vorliegt. Wenn man sich Mutationen von Patienten ansieht, so betreffen die Mutationen oftmals die Domänen die für die Lokalisation wichtig sind und die Dbl-Domäne. Geht man davon aus, dass diese Splicevarianten die "normale" Form dominieren wäre dies eine gleiche Situation wie eine Mutation in der Dbl-Domäne. Die Splicevariante bindet deutlich öfter als die "normale" Form, ist aber inaktiv und wirkt somit wie die mutierte Form.
In welchen Geweben die einzelnen Splicevarianten gefunden wurden finden Sie unten unter dem Punkt "Gewebeexpression".
Domänenstruktur
Proteine bestehen aus Aminosäuren, so auch das FGD1. Es gibt insgesamt 20 Aminosäuren(typen) die in Proteinen "verbaut" werden. Diese Aminosäuren lassen sich nach Größe, Ladung und Polarität (wasserliebend versus fettliebend) einteilen. Wir wollen hier aber nicht näher auf die einzelnen Aminosäuren(typen) eingehen, sondern vielmehr darauf verweisen, dass diese Aminosäuren durch ihre Reste die Faltung und dadurch auch die Funktion eines Proteins bestimmen. Es gibt dabei Abschnitte in einem Protein, die man als Domänen bezeichnet, die eine bestimmte Funktion aufweisen und dadurch in vielen Proteinen vorkommen, die eine ähnliche Funktion haben. Es gibt viele verschiedene Definitionen für eine Proteindomäne, der Einfachheit wollen wir uns hier eine Aminosäurenfolge vorstellen, die ein Modul bildet, welches eine bestimmte Funktion oder Struktur (für eine bestimmte Interaktion) darstellt.
Das FGD1 enthält im N-Terminalen Bereich (N-Terminus ist der Anfang des Proteins also die Seite bei der die Translation beginnt und das START-Codon der mRNA lag) eine "Proline-rich" Domäne. Diese Domäne ist dadurch gekennzeichnet, dass sie viele Proline (eine bestimmte Art von Aminosäure) besitzt. (Die genaue Sequenz lautet: KPQVPPKP - nur der Vollständigkeit halber.) Das P steht hierbei für Prolin. Diese Domäne ist wichtig für die Interaktion mit dem Cortactin und dem Arp2/3-Komplex. Beides Proteine die an das Aktin-Zytoskelett assoziiert sind und bei dessen Dynamik entscheidenden Einfluss haben. Kurz gesagt, durch diese Domäne ist das FGD1 am Aktin und an der Zellmembran lokalisiert. Der N-Terminus bestimmt somit die Lokalisation. (Diese Domäne zieht sich von Aminosäure 7 bis 330.)
In der Linkerregion zwischen der "Pro-rich"-Domäne und der Dbl-Domäne liegt ein Bereich der für den Abbau des FGD1 von großer Bedeutung ist, deshalb gehen wir hierauf kurz ein.
Jedes Protein muss nach seiner Funktion entweder inaktiviert oder degradiert und recycled werden. FGD-1 wird über das Proteasom abgebaut. Das Proteasom muss man sich wie eine "Tonne" in der Zelle vorstellen. Die Proteine werden zunächst über ein Enzymkomplex mit Ubiquitin (ein Molekül) markiert. Diese Markierung findet an einer spezifischen Aminosäurenklasse statt: dem Lysin. Ist das Protein markiert wandert es in das Proteasom und wird dort degradiert. Das FGD-1 wird in der Sequenz DSGIDS an den Serinen (ein weiterer Aminosäurentyp) phosphoryliert. Das S steht hier für ein Serin. Dies ist das Signal was die Enzymkette aktiviert, die für eine Ubiquitinilierung des FGD1 sorgt und anschließend zum Abbau führt. Die Regulation läuft über Cdc42 bzw. die PKCξ (Protein-Kinase-C Xi) über verschiedene Phosphorylierungsschritte. Es ist in der Biologie sehr oft so, dass die aktive Form (hier das Cdc-42-GTP) des "Produkts" (also das an dem FGD1 "angreift") das betreffende Protein steuert. Damit wird ganz allgemein eine "Endprodukt"-Hemmung gemeint. In diesem Regelkreis bestimmt der Status (die Aktivität) des Cdc42, ob mehr oder weniger FGD1 gebraucht wird. Ist Cdc42 inaktiv (ist kaum oder gar kein FGD-1 vorhanden), deshalb ist eine Zerstörungskaskade für FGD1 nicht notwendig. Ist aber viel FGD1 vorhanden und Cdc42 in einem aktivierten Zustand würde dieser aktive Zustand ewig dauern, würde FGD1 nicht zerstört. Nur durch die Zerstörung von FGD1 ist es möglich nach der Aktivierung von Cdc42 wieder in den "Normalzustand" bzw. Cdc42-GDP zurückzukehren.
Die zweite Domäne ist die DH-Domäne (253 - 561) die mit der dritten Domäne, der PH-Domäne (590 - 689) zur Dbl-Domäne zusammengefasst wird. Diese Struktur ist für die Aktivierung einer kleinen GTPase notwendig und kommt in jedem GTP-Austauschfaktor vor. In dieser Dbl-Domäne gibt es Unterschiede, die für eine Spezifität für bestimmte kleine GTPasen sorgen. Die beiden Domänen DH und PH bilden eine Tasche, in die genau der "Switch" (Schalter) der kleinen GTPase passt.
Die vierte Domäne ist eine FYVE-Domäne. Diese Art von Domäne interagiert mit Phosphatidylinositolen in der Zellmembran und bewirkt ebenfalls eine Lokalisation an die Zellmembran. Allerdings führt eine künstliche Deletion dieser Domäne zu keiner geänderten Lokalisation. Es könnte sich hierbei lediglich um eine Verstärkung der Membranbindung, die durch den N-Terminus einhergeht handeln, aber es ist auch möglich, dass mit dieser Domäne lösliche "second messanger" gebunden werden können und somit andere Signalwege komplett unabhängig von Cdc42 und der GTP-Funktion gesteuert werden. Dies deutet sich auch dadurch an, dass ein Konstrukt des FGD1, welches keine Dbl-Domäne mehr besitzt dennoch den JNK-Weg aktivieren kann. Es wurde ursprünglich angenommen, dass dieser Weg nur über Cdc42 und dann weiter über PAK1 aktiviert werden kann.
Die fünfte Domäne, ebenfalls eine PH (Pleckstrin-Homologie)-Domäne, liegt in Richtung C-Terminus, deren Funktion aber nicht näher bekannt ist.
Funktion als GTP Austauschfaktor für Cdc42
Die Hauptfuktion ist nach heutiger Lehrmeinung die GEF-Funktion auf Cdc42 und somit eine Aktivierung der kleinen GTPase Cdc42. Dies wird bestärkt dadurch, dass Mutationen in der FGD1 Dbl-Domäne in Aarskog-Scott-Syndrom-Patienten festgestellt werden konnten. Weitere Mutationen sind im N-Terminus zu finden, wodurch vermutlich eine korrekte Lokalisation des FGD1 am Zytoskeletts nichtmehr möglich ist. Als logische Konsequenz kann es nichtmehr an der richtigen Stelle wirken und kann seine Aufgabe am Zytoskelett nichtmehr wahrnehmen kann.
Weitere Funktionen
Es konnte gezeigt werden, dass FGD1 weitere Signalwege, wie etwa über das Serum-Responsive-Partikel (SRP), Elk-1 und JNK aktivieren kann. Diese Signalwege greifen in die Zellproliferation (Zellteilung) ein bzw. führen zu erhöhtem Zellwachstum. Aber was FGD1 hier genau macht und welche Rolle dies in unterschiedlichen Zelltypen spielt ist nicht geklärt. Sicher ist, FGD1 hat eine weitere Rolle neben der als GEF für Cdc42.