Grundlagen
PCR und Sequenzierung
Die PCR stellt eine Methode dar mit der spezifische DNA-Fragmente von einer Vorlage kopiert werden können. Der Name "PCR" ist die Kurzform für "polymerase chain reaction" im Englischen, was ins Deutsche übersetzt "Polymerase-Ketten-Reaktion" genannt wird. Für diese Reaktion beim Aarskog-Scott-Syndrom benötigt man genomische DNA. Sie ist in jeder Zelle des Körpers im Zellkern vorhanden und in jedem Zelltyp gleich ist.
Die genomische DNA, die das FGD1-Gen beinhaltet und die die Vorlage für die PCR bildet, wird aus Blutzellen isoliert. Dem Patienten werden dazu 5ml Blut entnommen und daraus über verschiedene Zentrifugationsschritte bestimmte Zellen isoliert. Diese Zellen werden als PBMCs bzw. "Peripheral Blood Mononuclear Cells" bezeichnet. Zu dieser Gruppe der runden und einkernigen Zellen des periphären Blutkreislaufs zählen zum Beispiel die weißen Blutkörperchen (Lymphozyten), aber auch Monozyten. Nach der Isolation werden diese Zellen lysiert (zerstört) und mit Hilfe spezieller Aufreinigungssäulchen die DNA isoliert.
Funktionsprinzip:
Da nicht die gesamte DNA mit vielen Millionen Basen kopiert werden soll, sondern nur bestimmte Bereiche des FGD1-Gens, müssen Anfang- und Enpunkte für den Kopiervorgang gesetzt werden. Hierzu werden kurze DNA-Stücke (ca. 20bp), auch Primer genannt, chemisch hergestellt. Diese Fragmente müssen komplementär zu der Sequenz sein, die die DNA aufweist. Da die DNA doppelsträngig vorliegt, mit zwei gegenläufigen Strängen, spricht man von "sense"- und "antisense"-Richtung des Einzelstranges. Hierbei wird der Strang von 5' zu 3' als "sense", der von 3' zu 5' als "antisense" bezeichnet. Komplementär sind Adenin (A) zu Thymin (T) und Guanin (G) zu Cytosin (C). Exon 1 des humanen FGD1 Gens kann als Beispiel dienen:
- Sequenz auf dem Genom (sense):
GGGGGCGCC GGGCCTTCGG AGCCCGAACA CCCGGCCACG AACCCGCCGG GCGCCGCTCC GCCGGCCTGT GCCGACTCGG ACCCTGGAGC CTCGGAACCC GGACTGCTGG CGCGCAGGGG CTCAGGTTCG GCTCTTGGCG GCCCACTGGA TCCCCAGTTT GTCGGACCCT CGGACACCAG CCTGGGCGCT GCTCCAGGCC ACCGGGTCTT GCCCTGCGGT CCCAGTCCAC AGCACCACCG GGCCCTGCGC TTCTCTTACC ACCTGGAGGG CTCGCAGCCT CGGCCTG - Sequenz des komplementären sense-Primers: TACGTACCGG TGGCTCGGGG (sense)
- Sequenz des komplementären antisense-Primers: CAGGCCGAGG CTGCGAGCCC (antisense)
Neben den Primern werden noch weitere Bestandteile wie die Nukleotide (enthält A, T, G, C), sowie entsprechende Pufferlösungen und letztlich ein Enzym, die Polymerase, benötigt. Als Besonderheit für die Sequenzierung werden für diese Reaktion neben den "normalen" Nukleotiden auch farbig markierte Nukleotide zugegeben, z.B. für Guanin (schwarz), Cytosin (blau), Adenin (grün) und Thymin (rot).
Die PCR-Reaktion
Die PCR-Reaktion gliedert sich in 3 Schritte:
- Denaturierung bei 95°C: der Doppelsträngige DNA-Strang, beim ersten Durchgang die genomische DNA, wird geschmolzen und liegt einsträngig vor
- Primer-Annealing bei variabler Temperatur ca. 50-65°C (je nach Primer): hierbei lagern sich die Primer an die einzelsträngige chromosomale DNA an
- Elongation bei 72°C: in diesem Schritt verlängert die DNA-Polymerase (das Enzym) den Primer; die Zeit der Elongation ist maßgeblich für die Verlängerung
Dieser Zyklus wird ca. 30 Mal durchlaufen, wobei exponentielles Wachstum vorliegt. Würde man mit 10 Molekülen genomischer DNA beginnen, hätte man nach dem ersten Zyklus 100 Moleküle (10x10) vorliegen, nach dem zweiten Zyklus 10000 (100x100), im dritten Zyklus 100000000 (10000x10000) usw. Nach Durchlaufen der 30 Zyklen wurden mehrere Milliarden DNA-Kopien hergestellt. Dies ist eine sehr effiziente Methode zur spezifischen DNA-Vervielfältigung.
Besonderheit der Sequenzierungsreaktion liegt in den farbig markierten Nukleotiden. Wird an einer Stelle ein solches Nukleotid eingebaut führt dies zu einem Abbruch der PCR-Reaktion in diesem Zyklus. Das so entstandene DNA-Molekül wird nicht mehr verändert. Als Beispiel soll wieder das Exon 1 dienen:
- ATGCATGGCC ACCGAGCCCC GGGGGGCGCC GGGCCTTCGG AGCCCGAACA CCCGGCCACG AACCCGCCGG GCGCCGCTCC GCCGGCCTGT GCCGACTCGG ACCCTGGAGC CTCGGAACCC GGACTG (nach schwarzem Guanin an Stelle 126 Abbruch)
- ATGCATGGCC ACCGAGCCCC GGGGGGCGCC GGGCCTTCGG AGCCCGAACA CCCGGCCACG AACCCGCCGG GCGCCGCTCC GCCGGCCTGT GCCGACTCGG ACCCTGGAGC CTCGGAACCC GGACTGC (nach blauem Cytosin an Stelle 125 Abbruch)
- ATGCATGGCC ACCGAGCCCC GGGGGGCGCC GGGCCTTCGG AGCCCGAACA CCCGGCCACG AACCCGCCGG GCGCCGCTCC GCCGGCCTGT GCCGACTCGG ACCCTGGAGC CTCGGAACCC GGACTGCT (nach rotem Thymin an Stelle 124 Abbruch)
Rein statistisch liegt von jeder Länge mindestens ein DNA-Fragment vor. Die amplifizierte DNA wird über eine Säule der größe nach aufgetrennt und durch einen Lichtstrahl gelenkt, der das farbig markierte Nukleotid anregt und zu einer Emission bzw. zum Leuchten bringt. Je nach Farbe kann nun zugeordnet werden, ob an dieser Stelle ein G, C, A oder T vorliegt. Dies lässt wiederum Rückschlüsse auf die genomischen DNA zu, die als Vorlage gedient hat.
Das Ergebnis ist ein Elektrophoretogramm, das für jede Base einen Peak (Ausschlag) für jede Farbe liefert. In dem unten abgebildeten Diagramm ist jeder Peak eine Base, von links nach rechts werden die Fragmente größer. So ist beispielsweise die vierte Spitze die Base 60, welche schwarz Leuchtet und somit einem Guanin entspricht:
